位置:首頁 > 新聞動態 > 科研進展  
魯非研究組開發高效率群體轉錄組研究技術

  RNA測序(RNA-Seq)是现代生物学研究的基石技术之一,将许多研究從单一的基因组水平提升到多组学水平,是解析基因组功能的强大工具。现有的全基因组水平的大规模測序以及高质量泛基因组的组装,为大规模转录组研究提供了广阔的空间,迫切需要高效的RNA-Seq技術進行深層次生物學解析。本研究綜合了已報道的3' RNA-Seq定制化建库方法的优点,并针對測序外包市场标准双端150bp/250bp(PE150/250)模式優化實驗設計,開發了一種通用高效的基因表達文庫構建方法,即簡化的poly(A)锚定測序(SiPAS)技術。通過在六倍體面包小麥中SiPAS性能的測試實驗,證實了SiPAS具有高水平的靈敏度、准確性和重複性,該技術有望成爲群體轉錄組學解析的利器,極大促進作物和許多其他植物遺傳學研究。 

 

  本研究基于已有的3' RNA-Seq的優勢和標准的PE150測序模式,從以下三个方面进行改进并评估。1)優化建庫流程更適用標准的PE150測序模式,因为更长的读段可以显著提高比對的准确性。2)由于碱基质量對比對的准确性有积极影响,通过调转測序接头,使用在Illumina測序中有着更高測序质量的R1端進行非poly(T)端的測序,提高測序质量。3)單細胞RNA-seq常用特異分子標識符(UMI)來校正PCR擴增導致的基因表達定量偏差,本研究評估了UMIbulk RNA-seq的校正效果。因此,設計了四種流程測試,即T1T2(調轉接頭)T3(添加UMI)T4(調轉接頭并添加UMI)进行對比实验(1) 

 

  本研究首先使用了模拟数据证实长读段和高碱基质量可以显著提高序列比對的灵敏度(0.75提高至0.95)。在实验结果中,通过調轉接頭提高碱基质量可以使单端比對的唯一比對率增加10.37%。在單細胞中常用UMI矯正PCR擴增偏好性,由于bulk RNA-Seq建庫的RNA起始量高擴增循環數少,UMIbulk RNA-Seq並非必需。在基因表達定量方面,長讀段和高堿基質量也可以顯著提高檢測准確性和重複性。綜合上述結果,優選出T2(調轉接頭)建立SiPAS技術。 

 

  優選後的SiPAS在基因差異表達分析方面有著與TruSeq類似的高效檢測能力,PCA分析表明,代表生物學差異的PC1解釋了總方差的78%,而代表SiPASTruSeq之間技術差異的PC2僅占總差異的18%。同时,两种建库方法對DEG (Differentially expressed gene) 鑒定的一致性達到了0.95(2)。另外,在使用Mg++離着cS機片段化模擬RNA降解的實驗中,SiPAS對降解RNA具备良好的检测能力,與對RNA完整性要求非常嚴格的建庫方法相比,SiPAS技術更適用于高通量群體轉錄組研究。 

 

  綜上,SiPAS在實現經濟高效($2/樣本)的基礎上,在基因表達定量方面達到了與TruSeq類似的性能,SiPAS有望在大規模群體轉錄組研究中發揮重要作用,成爲基因組功能解析的利器。 

 

  該研究成果于2021912日在線發表于Plant Biotechnology Journal雜志上(DOI:10.1111/pbi.13706),其核心技術已經申請國家發明專利(申請號:202111058665.4)。中國科學院遗传與发育生物学研究所鲁非组工程师王静、博士研究生徐俊和杨晓寒为该研究的共同第一作者,鲁非研究员为该研究的通讯作者。研究得到中國科學院战略性先导科技专项種子精准設計與創造(XDA24020201XDA24040102)和國家自然科學基金(3197063131921005)的支持。 

    

1SiPAS四种测试流程设计原理圖 

    

2SiPASTruSeq的性能比較 

    

 
网站地图