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高彩霞研究組開發出高精准胞嘧啶堿基編輯工具

  堿基編輯技術(Base Editing)是基于CRISPR系統開發的基因組定向修飾技術。該技術由于不需要DNA雙鏈斷裂和外源供體DNA可以实现对目的碱基的精准替换,在疾病治疗、植物性状改良等方面具有很大的应用潜力。腾讯彩票高彩霞研究组长期致力于植物基因组编辑技术的创新及应用研究,前期已经在植物中建立了完善的胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine Base Editor, CBE)和腺嘌呤堿基編輯器(Adenine Base Editor, ABE)技術體系(Zong et al., Nat. Biotechnol. 2017; Zong et al., Nat. Biotechnol. 2018; Li et al., Genome Biol. 2018),但是發現胞嘧啶堿基編輯器在基因組水平存在脫靶效應(Jin et al., Science 2019)。爲解決這一問題,高彩霞研究組通過對人類胞嘧啶脫氨酶(APOBEC3B)蛋白的理性設計,並結合新型的胞嘧啶堿基編輯篩選方法,開發出了新型高精度、高編輯活性的胞嘧啶堿基編輯工具。 

 

  研究人員首先在水稻原生質體中建立並優化了基于R-loop的高通量堿基編輯器特異性評估方法。該方法利用CBE作用于單鏈DNA的特性,通過SpCas9的正交蛋白nSaCas9在編輯靶點外的基因組區段誘導R-loop,從而人爲制造單鏈DNAsingle stand DNA, ssDNA)區域。如果CBE的脱氨活性在这些区域产生脱靶编辑,可以通過高通量测序进行富集检测。该工作首先对已报道的5个胞嘧啶碱基编辑器分别通過R-loop方法和全基因組測序(Whole-genome sequencing, WGS)進行特異性檢測,發現R-loop方法與 WGS的結果一致,證明了R-loop方法的可靠性。且该方法與WGS相比,更加快速、便捷和經濟。 

 

  在此基础上,研究人员通過对一系列理性设计的基于人源APOBEC脫氨酶的CBE的特異性進行篩選。以編輯效率高且編輯窗口小的A3Bctda truncated APOBEC3B deaminase with enzymatic activity)作爲蛋白進化的原始底盤,根據蛋白結構信息預測與其脫氨的催化活性和ssDNA结合能力相关的结构域以及这些结构域中的重要氨基酸残基,通過理性设计获得16個單氨基酸替換的CBE变体。通過筛选获得了靶向效率维持较高且能较显著降低脱靶效应的7種單個氨基酸突變(R211K, T214V,, R311K, Y313F, D314R, D314H Y315M)。爲了進一步降低CBE的脫靶效應,研究人員將這些單氨基酸突變進行組合創制了9個多氨基酸替換變體,最終篩選得到了兩種靶向編輯效率較高且特異性顯著增加的CBE變體:A3Bctd-VHM-BE3 A3Bctd-KKR-BE3。對編輯産物的分析顯示,這兩種變體在編輯窗口內主要産生單個C或者兩個C的替换,显著提升了编辑的精确性。最后,通過对150個水稻編輯植株的全基因組測序數據進一步證明了A3Bctd-VHM-BE3 A3Bctd-KKR-BE3的高特異性。 

 

  該工作結合基于結構信息的蛋白理性設計、植物個體全基因組脫靶檢測技術和高通量R-loop脫靶檢測技術,進一步提高了單堿基編輯的精確性,開發出的兩種能保持高編輯效率且無隨機脫靶效應的CBE變體,爲基因治療和植物分子設計育種提供了強有力的工具支撐。相關研究成果結果于2020727日在線發表在Molecular Cell雜志(DOI:10.1016/j.molcel.2020.07.005)。遗传发育所高彩霞研究组博士生靳帅、费宏源、朱子旭以及微生物所副研究员骆迎峰为本文的共同第一作者;高彩霞研究员与王延鹏青年研究员为本文共同通讯作者;明尼苏达大学张峰博士,遗传发育所陈宇航研究员也参与了这项研究。该研究得到了国家转基因重大科技专项、中國科學院战略性先导专项A、国家自然科学基金委和中國科學院青促会项目的资助。 

    

圖:理性設計改造胞嘧啶脫氨酶APOBEC3B,篩選精准堿基編輯器。上:根據APOBEC3B結構信息理性設計並創制突變體。中:水稻原生質體中建立R-loop方法,高通量檢測胞嘧啶堿基編輯器(CBE)變體特異性。下:利用全基因組測序,檢驗CBE變體特異性。

   

 
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